Questo può essere fatto in modi diversi, per ottenere risultati diveersi:

- a livello locale, nel topo adulto, utilizzando particolari strategie (principalmente vettori virali e DNA nudo) che permettono di modificare le cellule di un determinato tessuto, con un efficienza molto variabile a seconda del tipo di tessuto, del gene e del vettore

- nell'interno animale, agendo sulle cellule staminali embrionali o sullo zigote (la cellula risultante dalla fecondazione della cellula uovo con lo spermatozoo).

I termini animali trasgenici e topi knock-out si riferiscono a organismi del secondo gruppo, che presentano la modificazione genetica in tutte le cellule.

Esistono profonde differenze sia di procedura che nel risultato tra le due tipologie. Gli animali trasgenici sono generalmente caratterizzati dall'introduzione artificiale di un gene nel genoma. Questo è possibile inserendo il gene estraneo, o trasgene, direttamente all'interno del genoma dello zigote. In questo sono presenti due strutture simili a nuclei, chiamati pronucleo maschile e pronucleo femminile, che contengono, rispettivamente, la parte di genoma che deriva dallo spermatozoo maschile e da quello femminile. Generalmente, il DNA è inserito direttamente nel pronucleo maschile, riconoscibile perché più grande in molte specie.

Per l'inserimento si utilizzano degli strumenti particolari e si lavora al microscopio ottico. Questi strumenti comprendono una pipetta molto piccola, chiamata holder, che trattiene lo zigote in posizione esercitando una lieve aspirazione, grazie ad un piccolo compressore d'aria a fine regolazione. Un capillare cavo e appuntito, contenente il trasgene in soluzione salina, è fatto entrare all'interno del pronucleo, dove il DNA è rilasciato. Gli strumenti sono manovrati grazie ad un regolatore della pressione dell'aria all'interno di capillare e holder e a micromanipolatori per lo spostamento.

Gli zigoti sono inseriti in un terreno di coltura in un incubatore per alcune ore. A questo punto, i pronuclei si fondono dando origine al nucleo. Nel contempo il trasgene si inserisce casualmente all'interno del genoma. Le cellule fecondate sono inserite in un animale che porta avanti la gravidanza: i piccoli che nasceranno avranno tutte le cellule modificate geneticamente. Il luogo di integrazione del trasgene non è prevedibile: può inserirsi in zone del genoma non attive, può interrompere dei geni oppure può inserirsi in zone attive senza interrompere geni o strutture regolatorie. Per questo motivo, quando si utilizza questo modello animali per studiare, per esempio la funzione o le modalità di attivazione di un gene in un organismo, è necessario generare più linee, cioè più animali che derivino da differenti zigoti. In questo modo è possibile confrontare il fenotipo di animali ottenuti con esperimenti indipendenti: solo quando questo coincide o si manifesta nello stesso modo, o con intensità differente, si può ragionevolmente pensare che l'azione osservata sia dovuta al trasgene e non ad altre anomali indotte dall'inserzione nel genoma.

I topi trasgenici sono relativamente semplici da ottenere e hanno dato in passato risposte ad importanti domande della medicina e della biologia. Un motivo per cui sono spesso utilizzati è per vedere cosa accade in presenza di geni con funzionamento anomalo (per esempio, che si suppone possano dare il cancro) oppure per identificare in che momento, in che luogo e in base a quali stimoli sono attivati certi geni. In questo caso, generalmente, si utilizzano dei geni che danno un prodotto colorato, che visualizza il luogo e il momento in cui si ha l'attivazione genica direttamente in vivo.

Il trasgene è prodotto con le tecniche della biologia molecolare, e comprende normalmente quattro porzioni di DNA unite insieme: una sequenza regolatoria (il promotore), che permette l'attivazione del gene (in pratica, è l'interruttore), il gene d'interesse (o meglio, la trascrizione in DNA dell'mRNA derivato dal gene d'interesse), due sequenze con funzione di stabilizzazione (un introne e una sequenza per la poliadenilazione dell'mRNA).

La generazione di topi knock out avviene in modo completamente diverso. È sempre inserito un frammento di DNA che si integra nel genoma ospite, ma il frammento è costruito in modo diverso, inserito in un momento diverso dello sviluppo embrionale e si inserisce in modo completamente diverso all'interno del genoma. La differenza fondamentale è che un gene già presente nel genoma può essere sostituito, modificato o inattivato, mentre con i trasgeni si può solo inserire un gene in più. Individuato il gene d'interesse, si prepara una sequenza di DNA che contiene gli estremi simili a quelli della porzione da modificare, mentre l'interno è diverso.

La sequenza è inserita all'interno di cellule staminali embrionali. Queste si prelevano dall'embrione nella fase in cui si cavita, dando luogo ad una struttura caratteristica chiamata blastociste. Si tratta di cellule in grado di dare ciascuno origine ad un organismo intero. L'inserimento nelle cellule avviene mediante una tecnica chiamata elettroporazione: in pratica, alle cellule è applicata una piccola scossa di corrente elettrica, questa provoca l'apertura di piccoli pori sulla membrana che permettono l'ingresso del DNA, il quale con una probabilità di successo variabile a seconda della specie e del DNA, sostituisce il frammento interno con un processo di ricombinazione omologa che sfrutta le regioni identiche alla porzione del DNA da sostituire (simile al crossing over della meiosi). Le cellule staminali sono cresciute in coltura per identificare quelle che hanno integrato la modificazione genetica. L'identificazione avviene mediante selezione antibiotica (solo le cellule che hanno integrato il frammento di DNA, e lo hanno integrato nel punto corretto, sopravvivono).

A questo punto le cellule staminali sono reinserite dentro una blastocisti. La blastocisti è inserita in un animale che porta avanti la gravidanza. Nel caso dei topi, generalmente le cellule staminali utilizzate derivano da un animale con un colore del manto diverso da quello delle blastocisti che le ospitano. Gli animali che nascono da queste blastocisti sono composti in parte da cellule della blastocisti e in parte da cellule derivanti dalle cellule staminali modificate geneticamente, come si può osservare anche visivamente dall'osservazione del manto che appare striato di colori diversi, a seconda dell'origine. Per questo motivo questi animali sono indicati con il termine di chimera, per analogia con l'animale mitologico.

Se le cellule modificate geneticamente danno luogo a quelle della linea germinale (le cellule che danno origine a spermatozoi e oociti), dalle chimere nascono degli animali modificati geneticamente. Questa tecnica permette di inattivare i geni, metterli cioè knock-out, da cui la definizione di animale knock-out. In realtà, con la stessa tecnica possono essere ottenuti risultati importanti e diversi: esistono animali definiti knock-in, poiché il gene non è inattivato ma modificato, con l'aggiunta o rimozione di porzioni. Inoltre, con tecniche più sofisticate è possibile generare dei topi modificati geneticamente in cui la rimozione del gene avviene solo in determinati tessuti nell'adulto oppure dopo somministrazione di determinate sostanze. E' il caso dei mutanti condizionali, che permette di capire cosa succede se un gene è alterato in un tessuto adulto, per esempio per effetto di mutageni.

Lo studio di animali knock-out ha permesso di comprendere il ruolo di molti geni, alcuni dei quali già studiati senza successo in vitro.