AGGTTACAAG¹. Se lette al di fuori di un preciso contesto, queste lettere sono apparentemente prive di significato. Ma quando le consideriamo all'interno di un frammento più lungo di DNA acquistano immediatamente senso: se opportunamente raggruppate a tre a tre, specificano gli aminoacidi che una data proteina dovrà avere.

Sequenziare un frammento di DNA significa proprio leggere la successione di basi che esso contiene. Individuato l'ordine con cui A, C, G e T si alternano, il biologo molecolare può confrontare la sequenza in esame con sequenze già catalogate e archiviate in corposi database, in genere tutti on line, e verificarne l'esattezza o, in alternativa, la presenza di mutazioni. E capire se la proteina risultante funzionerà correttamente.

Oggi l'operazione di sequenziamento non viene più svolta manualmente: sequenziatori automatici processano il campione preparato dall'operatore e lo fanno correre su particolari gel o in elettroforesi capillare. La procedura, completamente automatizzata, permette di ridurre considerevolmente i costi e di analizzare un gran numero di campioni simultaneamente.

Fino a una decina di anni fa, quando la tecnologia non aveva raggiunto i livelli attuali di precisione e rapidità, il sequenziamento era un'operazione piuttosto lunga e laboriosa. Due erano le tecniche a disposizione: il metodo chimico secondo A.M. Maxam e W. Gilbert, e il metodo enzimatico secondo F. Sanger.

Pur essendo molto diverse, queste tecniche hanno un punto in comune: richiedono che venga generata una scaletta di frammenti di DNA a singolo filamento, ciascuno più lungo del precedente di una base (o nucleotide). In questo modo, frammenti di dimensioni crescenti possono essere separati in base alla lunghezza utilizzando l'elettroforesi su gel di poliacrilammide, dove l'operatore ha cura di caricare in diverse corsie i quattro prodotti della reazione. A corsa ultimata, il gel viene messo a contatto con una pellicola radiografica sulla quale lascia impressa la disposizione delle bande: l'immagine ottenuta, letta di seguito, darà la sequenza delle basi.

Il metodo chimico secondo Maxam e Gilbert, oggi praticamente abbandonato, impiega fosforo radioattivo (³²P) per marcare le molecole a un'estremità. In seguito, il DNA da analizzare viene ripartito in quattro provette, una per nucleotide (A, C, G, T), e sottoposto a un trattamento chimico che modifica un tipo solo di base per provetta. Le condizioni della reazione sono tali che, mediamente, ogni molecola di DNA viene modificata una sola volta. Si aggiunge poi una sostanza chiamata piperidina che taglia la catena di DNA a livello della base modificata, e quindi si procede all'analisi dei frammenti generati mediante corsa elettroforetica su gel.

Il metodo enzimatico secondo Sanger (Frederick Sanger è stato due volte premio Nobel poiché ha caratterizzato la struttura dell'insulina e messo a punto il metodo di sequenziamento del DNA) è ancora utilizzato nei piccoli laboratori, o laddove la sequenza non è un'operazione di routine, fatto che rende preferibile affidare il servizio a ditte specializzate.

Il DNA a singola elica viene sempre ripartito in provette separate, corrispondenti ai quattro nucleotidi, e trattato in modo da legarsi a un piccolo innesco di 20 basi. Questa porzione a doppia elica è necessaria affinché l'enzima artefice della reazione, la DNA polimerasi, possa allungare la catena. La polimerasi procede lungo il DNA inserendo nucleotidi normali (dNTP) marcati con zolfo radioattivo. Ogni tanto, però, incorpora particolari nucleotidi (ddNTP, cioè didesossinucleotidi) presenti nella miscela di reazione che sono in grado di arrestare la crescita della catena. Così si generano nuovamente frammenti di lunghezza scalare, che vengono risolti come nel metodo chimico, prima su gel e poi con autoradiografia.

Note:

1) La sequenza presentata è una piccola porzione del gene per la beta globina del topo (Mus musculus).